এমআরএনএ ওষুধ উত্পাদন প্রক্রিয়ার সম্পূর্ণ বিশ্লেষণ: কীভাবে টিএফএফ প্রযুক্তি বিশুদ্ধকরণ চ্যালেঞ্জগুলি সমাধান করে

সাম্প্রতিক বছরগুলিতে, এমআরএনএ প্রযুক্তি বায়োফার্মাসিউটিক্যাল ক্ষেত্রে যুগান্তকারী অগ্রগতি অর্জন করেছে, বিশেষ করে ভ্যাকসিন এবং জিন থেরাপিতে ব্যাপক প্রয়োগের সম্ভাবনা প্রদর্শন করে। mRNA ভ্যাকসিনের সফল বিকাশ শুধুমাত্র সংক্রামক রোগ প্রতিরোধ ও নিয়ন্ত্রণের জন্য নতুন সমাধান প্রদান করেনি, বরং ক্যান্সার ইমিউনোথেরাপি এবং ব্যক্তিগতকৃত ওষুধেও অগ্রগতি করেছে। থেরাপিউটিক পণ্যগুলির একটি অভিনব শ্রেণী হিসাবে, বড়-মাপের mRNA উত্পাদন অত্যন্ত চ্যালেঞ্জিং, যার মধ্যে RNA স্থিতিশীলতার নিয়ন্ত্রণ, অবশিষ্ট এনজাইমগুলি অপসারণ এবং -পণ্য দ্বারা প্রতিক্রিয়া, বাফার বিনিময়, এবং উচ্চ-বিশুদ্ধতা পুনরুদ্ধারের হার অর্জনের সাথে জড়িত, এই সমস্ত কিছুর সাথে প্রযুক্তিগত প্রযুক্তির প্রয়োজন। নিয়ন্ত্রক-অনুমোদিত সমাধান।

mRNA ভ্যাকসিন বা থেরাপিউটিকস তৈরির প্রক্রিয়া প্রধানত তিনটি পর্যায়ে বিভক্ত: প্লাজমিড ডিএনএ বাল্ক দ্রবণ তৈরি, এমআরএনএ বাল্ক দ্রবণ প্রস্তুত, এবং এমআরএনএ-এলএনপি ওষুধের পণ্য তৈরি।

mRNA ড্রাগ ম্যানুফ্যাকচারিং প্রসেস ফ্লোচার্ট

 

স্পর্শক প্রবাহ পরিস্রাবণ (TFF), একটি সুপ্রতিষ্ঠিত ঝিল্লি বিচ্ছেদ প্রযুক্তি হিসাবে, উচ্চ-দক্ষতা আণবিক চালনা ক্ষমতা, নিয়ন্ত্রণযোগ্য বাফার বিনিময় এবং কম শিয়ার স্ট্রেস বৈশিষ্ট্যের কারণে mRNA উত্পাদনে ব্যাপকভাবে প্রয়োগ করা হয়। মেমব্রেন মডিউল ডিজাইনের উপর ভিত্তি করে, সাধারণ TFF কনফিগারেশনের মধ্যে রয়েছে ফ্ল্যাট-শীট ক্যাসেট এবং হোলো-ফাইবার মডিউল। উপরন্তু, চাপ-টিএফএফ-এ মেমব্রেন বিচ্ছেদকে মাইক্রোফিল্ট্রেশন (এমএফ), আল্ট্রাফিল্ট্রেশন (ইউএফ), ন্যানোফিল্ট্রেশন (এনএফ), এবং রিভার্স অসমোসিস (আরও) এ মেমব্রেনের ছিদ্রের আকার অনুযায়ী ক্রমবর্ধমান নির্বাচনীতা সহ শ্রেণীবদ্ধ করা যেতে পারে।

 

প্লাজমিড ডিএনএ বাল্ক, এমআরএনএ বাল্ক উৎপাদন, এবং এমআরএনএ-এলএনপি ওষুধের চূড়ান্ত প্রণয়ন সহ mRNA ওষুধ উৎপাদনের একাধিক ধাপে TFF একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। মেমব্রেনের ধরন, আণবিক ওজন কাটা-অফ (MWCO) এবং ঝিল্লি উপাদানের উপযুক্ত নির্বাচনের মাধ্যমে, TFF-পণ্য এবং কম-আণবিক-ওজন অমেধ্যের প্রতিক্রিয়াকে কার্যকরীভাবে অপসারণ করতে সক্ষম করে, পাশাপাশি Lca-এর আগে এবং পরে উভয় ক্ষেত্রেই বাফার বিনিময় এবং ঘনত্বকে সহজতর করে। এটি উল্লেখযোগ্যভাবে RNA বিশুদ্ধতা, স্থিতিশীলতা এবং সামগ্রিক প্রক্রিয়ার মাপযোগ্যতা বাড়ায়।

 

উপরন্তু, স্পর্শক প্রবাহ পরিস্রাবণের কার্যকারিতা সিস্টেম কনফিগারেশন কারণগুলির দ্বারা প্রভাবিত হয় যেমন পাম্পের ধরন এবং টিউবিং ডিজাইন, সেইসাথে ট্রান্সমেমব্রেন চাপ (TMP), শিয়ার স্ট্রেস এবং পরিস্রাবণ ফ্লাক্স সহ মূল প্রক্রিয়া পরামিতিগুলি। লক্ষ্য পণ্যের বৈশিষ্ট্যের উপর ভিত্তি করে এই বিষয়গুলিকে অবশ্যই সাবধানে নির্বাচন করা এবং অপ্টিমাইজ করা উচিত, বিশেষ করে চাপের জন্য{1}}সংবেদনশীল পণ্য যেমন mRNA–LNP, যা প্রক্রিয়াকরণের সময় বাহ্যিক যান্ত্রিক শক্তির জন্য অত্যন্ত সংবেদনশীল।

 

প্লাজমিড ডিএনএ পরিশোধন

প্লাজমিড ডিএনএ স্টক সলিউশনের প্রস্তুতি মূলত ট্রান্সক্রিপশন টেমপ্লেটের সিকোয়েন্স ডিজাইনের উপর ভিত্তি করে। প্রস্তুতির পদ্ধতিগুলি সাধারণত প্লাজমিড ডিএনএ পরিবর্ধনকে জড়িত করে, যদিও পিসিআর পরিবর্ধনও ব্যবহার করা যেতে পারে। একটি উদাহরণ হিসাবে ডিএনএ পরিবর্ধন গ্রহণ, ইঞ্জিনিয়ারডই. কোলিসাধারণত গাঁজন-ভিত্তিক পরিবর্ধনের জন্য ব্যবহৃত হয়। ডাউনস্ট্রিম পরিশোধন প্রক্রিয়ার মধ্যে প্রধানত কোষ সংগ্রহ, লাইসিস এবং স্পষ্টীকরণ, ঘনত্ব এবং বাফার বিনিময়, জীবাণুমুক্ত পরিস্রাবণ, লিনিয়ারাইজেশন এবং ক্রোমাটোগ্রাফিক পরিশোধন অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। শিল্প সেটিংসে, ক্রমাগত-প্রবাহ সেন্ট্রিফিউগেশন প্রায়শই কোষ সংগ্রহের জন্য ব্যবহৃত হয়, তবে এটি তুলনামূলকভাবে উচ্চ শিয়ার ফোর্স তৈরি করে। ফাঁপা ফাইবার সিস্টেম, তাদের খোলা চ্যানেল এবং কম শিয়ার সহ, উচ্চ কঠিন বিষয়বস্তু, উচ্চ সান্দ্রতা, বা শিয়ার সংবেদনশীলতা, যেমন প্লাজমিড ডিএনএ সহ নমুনাগুলি পরিচালনার জন্য আরও উপযুক্ত। সংগ্রহের পরে, কোষগুলি উচ্চ-চাপের সমজাতীয়করণ, আল্ট্রাসোনিকেশন বা ক্ষারীয় লাইসিসের শিকার হয়, যার পরে গভীরতা পরিস্রাবণের মাধ্যমে প্রাথমিক ব্যাখ্যা করা হয়।

 

পরবর্তী ক্রোমাটোগ্রাফি সহজতর করার জন্য, 30 kDa, 100 kDa, বা 300 kDa এর আণবিক ওজন কাট- সহ ঝিল্লি ক্যাসেট বা ফাঁপা ফাইবার কলাম ব্যবহার করে স্পর্শক প্রবাহ পরিস্রাবণ (TFF) প্রায়শই ঘনত্ব এবং বাফার বিনিময়ের জন্য প্রথমে নিযুক্ত করা হয়। এটি একই সাথে কিছু অমেধ্য যেমন RNA, হোস্ট সেল প্রোটিন (HCP), এবং হোস্ট সেল ডিএনএ ফ্র্যাগমেন্ট (HCD) অপসারণের সময় নমুনার পরিমাণ হ্রাস করে। ক্রোমাটোগ্রাফি মূল পরিশোধন পদক্ষেপ হিসাবে কাজ করে। সাধারণত, অ্যানিয়ন এক্সচেঞ্জ ক্রোমাটোগ্রাফি (AEX) হাইড্রোফোবিক ইন্টারঅ্যাকশন ক্রোমাটোগ্রাফি (HIC) এর সাথে একত্রিত হয় যাতে দক্ষতার সাথে অমেধ্য অপসারণ করা হয় এবং উচ্চ বায়োঅ্যাকটিভ সুপারকোয়েলড প্লাজমিড ডিএনএ সমৃদ্ধ করা হয়, যার ফলে প্লাজমিড বিশুদ্ধতা উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত হয়।

 

বিশুদ্ধকরণের পর, প্লাজমিডকে আবার TFF করা হয় লক্ষ্য ঘনত্বের (সাধারণত 0.5-2 mg/mL) সমাধানকে কেন্দ্রীভূত করতে এবং চূড়ান্ত স্টোরেজ বাফারের সাথে ডায়ালাইসিস করতে। এই পদক্ষেপটি প্রক্রিয়া থেকে অবশিষ্ট লবণ এবং জৈব দ্রাবকগুলিকে সরিয়ে দেয়, নিশ্চিত করে যে বাফার সিস্টেম ডাউনস্ট্রিম ইন ভিট্রো ট্রান্সক্রিপশন (IVT) প্রতিক্রিয়াগুলির জন্য প্রয়োজনীয়তা পূরণ করে।

 

ইন ভিট্রো ট্রান্সক্রাইবড (IVT) mRNA এর পরিশোধন

ইন ভিট্রো ট্রান্সক্রিপশন (IVT) এবং পরিবর্তন হল mRNA স্টক সলিউশন তৈরির মূল প্রক্রিয়া। IVT mRNA উৎপাদনের সময়, স্পর্শক প্রবাহ পরিস্রাবণ (TFF1)- ক্রোমাটোগ্রাফি - স্পর্শক প্রবাহ পরিস্রাবণ (TFF2) এর সংমিশ্রণ নিযুক্ত করা হয়। এই কৌশলটি mRNA-এর দক্ষ এবং উচ্চ-গুণমান পরিশোধন নিশ্চিত করে, ভ্যাকসিন তৈরির জন্য গুরুত্বপূর্ণ সহায়তা প্রদান করে।

ট্রান্সক্রিপশন এবং পরিবর্তনের প্রতিক্রিয়া সম্পন্ন হওয়ার পরে, 30 kDa, 100 kDa, বা 300 kDa এর আণবিক ওজন কাটা-সহ ঝিল্লি ক্যাসেট বা ফাঁপা ফাইবার কলাম ব্যবহার করে আল্ট্রাফিল্ট্রেশন/ডায়াফিল্ট্রেশন সাধারণত প্রথমে করা হয়। এই পদক্ষেপটি কার্যকরভাবে প্রতিক্রিয়া সিস্টেম থেকে বিভিন্ন প্রক্রিয়ার-সম্পর্কিত অমেধ্যগুলিকে সরিয়ে দেয়, যেমন RNA পলিমারেজ, অবশিষ্ট DNA খণ্ড, অপ্রতিক্রিয়াবিহীন NTP, ক্যাপিং এনজাইম, ডবল-স্ট্র্যান্ডেড RNA (dsRNA), এবং ছোট-অণু ইনহিবিটর, একই সাথে বিনিময় অর্জনের সময়। একটি একক স্পর্শক প্রবাহ পরিস্রাবণ পদক্ষেপের পরে, বেশিরভাগ অমেধ্যগুলি কার্যকরভাবে অপসারণ করা হয় এবং একমাত্র সনাক্তযোগ্য অবশিষ্ট প্রোটিন অশুদ্ধতা হল RNA পলিমারেজ।

পরবর্তীকালে, আরও বিশুদ্ধকরণের জন্য একাধিক ক্রোমাটোগ্রাফি কৌশল প্রয়োগ করা হয়। সাধারণত ব্যবহৃত পদ্ধতিগুলির মধ্যে রয়েছে অ্যাফিনিটি ক্রোমাটোগ্রাফি, সাইজ-বর্জন ক্রোমাটোগ্রাফি, আয়ন-পেয়ার রিভার্স-ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফি, এবং আয়ন-এক্সচেঞ্জ ক্রোমাটোগ্রাফি। আল্ট্রাফিল্ট্রেশন এবং ক্রমিক ক্রোমাটোগ্রাফির এই সমন্বয়ের মাধ্যমে, এমআরএনএ উচ্চ স্তরের বিশুদ্ধতা অর্জন করে।

 

ফর্মুলেশন বা স্টোরেজ প্রয়োজনীয়তা পূরণের জন্য, mRNA স্টক দ্রবণকে আবার ঘনীভূত করা হয় বা 30 kDa, 100 kDa, বা 300 kDa মেমব্রেন ক্যাসেট বা ফাঁপা ফাইবার কলাম ব্যবহার করে সুনির্দিষ্টভাবে লক্ষ্য ঘনত্ব সামঞ্জস্য করতে এবং চূড়ান্ত ফর্মুলেশন বাফারে বিনিময় করা হয়। অবশেষে, জীবাণুমুক্ত-গ্রেড পরিস্রাবণ অণুজীব লোড নিয়ন্ত্রণে প্রয়োগ করা হয়, সাময়িক সঞ্চয়স্থান এবং উপাদান পূরণ করে।

Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH)।

 

mRNA-LNP ফর্মুলেশনের পরিশোধন

লিপিড ন্যানো পার্টিকেলস (LNPs) বর্তমানে mRNA থেরাপিউটিকসের জন্য সবচেয়ে ব্যাপকভাবে অধ্যয়ন করা বিতরণ ব্যবস্থা। বর্তমানে, বিভিন্ন mRNA-LNP ফর্মুলেশন প্রিক্লিনিকাল এবং ক্লিনিকাল বিকাশের বিভিন্ন পর্যায়ে রয়েছে। এলএনপিগুলি উত্পাদন প্রক্রিয়াগুলির জন্য অত্যন্ত সংবেদনশীল। mRNA-LNP উৎপাদনের জন্য প্রয়োজনীয় ইউনিট অপারেশনগুলির মধ্যে, স্পর্শক প্রবাহ পরিস্রাবণ (TFF) এর মাধ্যমে ঘনত্ব এবং বাফার বিনিময় এবং সেইসাথে জীবাণুমুক্ত পরিস্রাবণ উল্লেখযোগ্য চ্যালেঞ্জ রয়েছে। মেমব্রেন ফাউলিং এবং ভুল ফিল্টার লোডিং এর মতো সমস্যাগুলি এড়িয়ে চলার সময় প্রক্রিয়া স্কেলেবিলিটি এবং পণ্যের গুণমান নিশ্চিত করতে এই পদক্ষেপগুলি সাবধানে অপ্টিমাইজ করা উচিত।

 

mRNA এনক্যাপসুলেশনের পরে, স্পর্শক প্রবাহ পরিস্রাবণ (TFF) পরিশোধনের জন্য ব্যবহৃত হয়। এই পদক্ষেপের উদ্দেশ্য হল unencapsulated mRNA, মুক্ত পলিমার বা লিপিড পদার্থ, সেইসাথে mRNA এবং লিপিড থেকে অবশিষ্ট দ্রাবক অপসারণ করা। যেহেতু mRNA-LNPs ঘরের তাপমাত্রায় সীমিত স্থিতিশীলতা প্রদর্শন করে, তাই TFF সহ ডাউনস্ট্রিম প্রক্রিয়াগুলির অপ্টিমাইজেশন পণ্যের গুণমান বজায় রাখার জন্য গুরুত্বপূর্ণ।

মূল অপ্টিমাইজেশন নির্দেশাবলীর মধ্যে রয়েছে: পরিস্রাবণ দক্ষতা এবং কণার চাপের ভারসাম্যের জন্য mRNA-LNPs-এর কণার আকার এবং স্থায়িত্বের উপর ভিত্তি করে যথাযথভাবে ট্রান্সমেমব্রেন চাপ (TMP) এবং স্পর্শক প্রবাহ হার নির্ধারণ করা; কণার শোষণ বা ক্ষতি কমিয়ে মুক্ত mRNA, অমেধ্য এবং বিনিময় বাফারকে দক্ষতার সাথে অপসারণের জন্য উপযুক্ত আণবিক ওজন কাটা-অফ (MWCO, যেমন, 100 kDa বা 300 kDa) সহ ঝিল্লি বা ফাঁপা ফাইবার কলাম নির্বাচন করা; এবং লক্ষ্য গঠনে কার্যকর বাফার বিনিময় নিশ্চিত করতে এবং চূড়ান্ত কণার ঘনত্ব এবং বিচ্ছুরণ নিয়ন্ত্রণ করতে ঘনত্ব এবং ডায়াফিল্ট্রেশন ভলিউম অপ্টিমাইজ করা।

 

অতিরিক্তভাবে, সমালোচনামূলক গুণমানের বৈশিষ্ট্যগুলি (যেমন কণার আকার, পলিডিসপারসিটি সূচক [PDI], এবং mRNA এনক্যাপসুলেশন দক্ষতা) অবশ্যই প্রক্রিয়া চলাকালীন নিবিড়ভাবে পর্যবেক্ষণ করা উচিত, এবং স্থিতিশীল, মাপযোগ্য, এবং দক্ষ পরিশোধন এবং mRNNA{1}} তৈরি করার জন্য বাস্তব-সময় ডেটার উপর ভিত্তি করে প্যারামিটারগুলি গতিশীলভাবে সামঞ্জস্য করা উচিত।

 

উপরন্তু, টার্মিনাল নির্বীজন পদ্ধতির অধীনে mRNA-LNPs এবং তাদের উপাদানগুলির অস্থিরতার কারণে, একটি 0.2 µm জীবাণুমুক্ত-গ্রেড ফিল্টার সাধারণত ব্যাকটেরিয়া এবং অন্যান্য অণুজীব দূষক অপসারণ করতে ব্যবহৃত হয়।