সংক্ষিপ্তসার:

এই নিবন্ধটি দুটি মূল কারণ পর্যালোচনা করে যা প্রোটিন পরিশোধন কৌশলগুলিতে বিবেচনা করা উচিত: ডাউনস্ট্রিম অ্যাপ্লিকেশন প্রয়োজনীয়তা এবং নিজেরাই প্রোটিনগুলির জৈবিক বৈশিষ্ট্য। নিবন্ধটি জোর দেয় যে উচ্চ-মানের প্রোটিন পরিশোধন পরীক্ষামূলক তথ্যের নির্ভরযোগ্যতা এবং পুনরাবৃত্তিযোগ্যতার ভিত্তি, বিশেষত রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিনগুলির উত্পাদনের জন্য। বিভিন্ন প্রয়োগের পরিস্থিতিতে প্রোটিন বিশুদ্ধতা, ক্রিয়াকলাপ বা এন্ডোটক্সিন সামগ্রীর জন্য নির্দিষ্ট প্রয়োজনীয়তা রয়েছে এবং প্রোটিন বৈশিষ্ট্যগুলি পরিশোধন কৌশলগুলিকে উল্লেখযোগ্যভাবে প্রভাবিত করতে পারে। নির্দিষ্ট কেস অনুসারে, নিবন্ধটি চিত্রিত করে যে অনন্য প্রোটিনগুলি কাস্টমাইজড পরিশোধন প্রকল্পগুলি গ্রহণ করা উচিত। পরিশেষে, একটি পদ্ধতিগত প্রোটিন উত্পাদন প্রক্রিয়া প্রস্তাবিত হয়েছিল (চিত্র 1), এক্সপ্রেশন সিস্টেম নির্বাচন থেকে সম্পূর্ণ প্রক্রিয়া মানের নিয়ন্ত্রণের উপর জোর দেওয়া, শুদ্ধকরণ অপ্টিমাইজেশনে নির্মাণ নকশা এবং বায়োফিজিকাল কৌশলগুলির মাধ্যমে প্রোটিন সমজাতীয়তা এবং কার্যকারিতার মূল্যায়ন (যেমন সেক-ম্যালস, ডিএসএফ ইত্যাদি) এর পরামর্শ দেওয়া হয়েছিল। এই নিবন্ধটির লক্ষ্য গবেষকদের জন্য ব্যবহারিক দিকনির্দেশনা সরবরাহ করা, তাদের লক্ষ্য প্রোটিনগুলির বৈশিষ্ট্য এবং প্রয়োগের প্রয়োজনীয়তার উপর ভিত্তি করে দক্ষ এবং পুনরাবৃত্তিযোগ্য পরিশোধন কৌশলগুলি তৈরি করতে সহায়তা করা, যার ফলে বৈজ্ঞানিক গবেষণার গুণমান এবং দক্ষতা বাড়ানো।

 

চিত্র 1। প্রোটিন উত্পাদন প্রক্রিয়া স্কিম্যাটিক ডায়াগ্রাম

 

উচ্চ -চাহিদা প্রোটিন উত্পাদন - সমস্যা সনাক্তকরণ, প্রশমন কৌশল নকশা এবং সংশ্লিষ্ট আউটপুট উদাহরণ

 

1. প্রোটিনের সাথে নুক্লিক অ্যাসিড বাঁধাই:

নিউক্লিক অ্যাসিড বাইন্ডিং প্রোটিনগুলি শুদ্ধ করার সময়, নিউক্লিক অ্যাসিড দূষণ অপসারণ করতে একাধিক পদক্ষেপের প্রয়োজন হয়। লিসিসের সময়, নিউক্লিজগুলি (যেমন এসএম নিউক্লিজ (বেনজোনাস) বা ডিএনএএস বা আরএনএএস) যুক্ত করা দরকার, তবে আবদ্ধ নিউক্লিক অ্যাসিডগুলি সম্পূর্ণরূপে অপসারণ করা যায় না। নিউক্লিক অ্যাসিড অপসারণ পদক্ষেপগুলি যেমন পিইআই বা স্ট্রেপ্টোমাইসিন সালফেট বৃষ্টিপাত, হেপারিন পরিশোধন বা আয়ন-এক্সচেঞ্জ ক্রোমাটোগ্রাফি প্রতিস্থাপন করুন। নিউক্লিক অ্যাসিডগুলির উপস্থিতি শুদ্ধকরণ প্রক্রিয়া জুড়ে A26 0 nm/a28 0 nm এর অনুপাত দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। যদি অনুপাতটি 0.6 এর চেয়ে কম থাকে তবে এটি ইঙ্গিত দেয় যে প্রোটিন বিশুদ্ধতা তুলনামূলকভাবে বেশি এবং নিউক্লিক অ্যাসিড দূষণ ন্যূনতম ছিল। দৃ strongly ়ভাবে আবদ্ধ নিউক্লিক অ্যাসিডযুক্ত প্রোটিনগুলির জন্য, এগুলি অস্থায়ীভাবে অস্বীকৃত হতে পারে (যেমন ইউরিয়া দিয়ে চিকিত্সা করা) এবং তারপরে রেনেটুরেটেড হতে পারে। মূল পয়েন্টগুলি: উচ্চ-মানের রিএজেন্টস, তাজা বাফার এবং পরিষ্কার কলামগুলি ব্যবহার করুন (ব্যবহারের আগে 0.5 মিটার নওএইচ দিয়ে পরিষ্কার করুন)।

 

2। মাউস ফেরিটিন ভারী চেইন:

পরিশোধিত মাউস ফেরিটিন হেভি চেইন (এমএফটিএইচ 1) প্রোটিন উত্পাদন করার উদ্দেশ্য হ'ল উচ্চ-রেজোলিউশন একক কণা ক্রিও-ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি (ক্রিও-ইএম)। Escherichia কলি এক্সপ্রেশন ভেক্টর এনকোডযুক্ত লেবেলযুক্ত এমএফটিএইচ 1 কোনও নিউক্লিজ যুক্ত না করে আল্ট্রাসোনিকভাবে ব্যাহত হয়েছিল। 7 0 ডিগ্রিতে গরম করার পরে, এটি অ্যামোনিয়াম সালফেট বৃষ্টিপাত, ডায়ালাইসিস এবং আকার বর্জন ক্রোমাটোগ্রাফি পদক্ষেপের মধ্য দিয়ে যায়। ফলস্বরূপ নমুনাটি ক্রিও-ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি চিত্রগুলিতে (চিত্র 2 এ) প্রচুর পরিমাণে দূষকগুলির উপস্থিতি দেখিয়েছিল, যা এর প্রয়োগের জন্য সম্পূর্ণ অনুপযুক্ত ছিল। পদক্ষেপগুলি অনুকূলিত করুন। সেল লিসিস প্রক্রিয়া এবং অ্যামোনিয়াম সালফেট বৃষ্টিপাতের পরে ডায়ালাইসিস প্রক্রিয়া চলাকালীন এসএম নিউক্লিজ যুক্ত করুন এবং তারপরে A26 0 nm/a280nm 1.4 থেকে 0.8 থেকে অনুপাত হ্রাস করতে অ্যানিয়ন এক্সচেঞ্জ ক্রোমাটোগ্রাফি পদক্ষেপ যুক্ত করুন। আকার বর্জন ক্রোমাটোগ্রাফির পরে, চূড়ান্ত এমএফটিএইচ 1 নমুনার A260NM/A280NM এর অনুপাত 0.56 ছিল। এসডিএস-পৃষ্ঠা এবং ক্রিও-ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি চিত্রগুলি (চিত্র 2 বি) দেখিয়েছিল যে প্রোটিনটি খুব খাঁটি ছিল, এটি ইঙ্গিত করে যে দূষকগুলি কার্যকরভাবে অপসারণ করা হয়েছিল।

চিত্র 2 মাউস ফেরিটিন ভারী চেইন

 

 

 

3। চিমেরিক প্রোটিন হিউম্যান ডিএসআরবিইসি (ডিএসআরবিডি-ইজিএফ- চিমেরা):

ডিএসআরবিইসি হিউম্যান প্রোটিন কিনেস আর এবং হিউম্যান এপিডার্মাল গ্রোথ ফ্যাক্টর (এইচইজিএফ) এর ডাবল স্ট্র্যান্ডড আরএনএ বাইন্ডিং ডোমেন (ডিএসআরবিডি) এর ফিউশন দ্বারা গঠিত হয়। যখন ডিএসআরবিডি এসেরিচিয়া কোলিতে প্রকাশ করা হয়, এটি একটি অত্যন্ত উচ্চ ডিএসআরএনএ বাইন্ডিং ক্ষমতা দেখায়। সেল লিসিসের পরে, দূষিত আরএনএ স্থির ধাতব আয়ন অ্যাফিনিটি ক্রোমাটোগ্রাফি (আইএমএসি) কলামে রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিনগুলির বাঁধাইকে বাধা দেবে। প্রচলিত পদ্ধতি যেমন পিইআই বা স্ট্রেপ্টোমাইসিন সালফেট বৃষ্টিপাত, আরএনএএস চিকিত্সা বা উচ্চ-লবণ বাফার সমাধানগুলি আরএনএ অপসারণ করতে পারে না। সেল লিসিস 4 এম ইউরিয়াযুক্ত একটি বাফার ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল। সুপারেনট্যান্টটি একটি আইম্যাক কলামে লোড করা হয়েছিল, এবং 4 মি থেকে 0 এম ইউরিয়া আস্তে আস্তে রাতারাতি (কলাম পুনর্নির্মাণ) ব্যবহার করা হয়েছিল। রেন্যাটরেশন বাফারটি ইমিডাজোলের সাথে যুক্ত করা হয়েছিল এবং আইম্যাক কলাম থেকে এলিটেড। কার্যকরীভাবে সক্রিয় ডিএসআরবিইসি পাওয়ার জন্য সুপারডেক্স 75 জেল পরিস্রাবণের মাধ্যমে চূড়ান্ত পরিশোধন করা হয়েছিল।

 

4। ডিভ্যালেন্ট কেশন বা অন্যান্য কোফ্যাক্টরগুলিতে আবদ্ধ প্রোটিনগুলি:

প্রোটিনগুলির জন্য যা zn 2+, ফে 2+, কিউ 2+, বা অন্যান্য কোফ্যাক্টরগুলির মতো ডিভেলেন্ট কেশনগুলির সাথে যোগাযোগ করে, বা অন্যান্য কোফ্যাক্টরগুলি প্রকাশের সময় নির্দিষ্ট ডিভেলেন্ট কেশন (বা অন্যান্য কোফ্যাক্টর) যুক্ত করা গুরুত্বপূর্ণ। পরিশোধন প্রক্রিয়া চলাকালীন একই ডিভেলেন্ট কেশনগুলির একটি অল্প পরিমাণ (বা অন্যান্য কোফ্যাক্টর) প্রয়োজন। তবে যে কোনও চেলটিং এজেন্ট (যেমন ইডিটিএ, ইজিটিএ) এবং চেলটিং হ্রাসকারী এজেন্টদের (যেমন ডিটিটি বা ডিটিই) ব্যবহার এড়ানো উচিত। ডিভেলেন্ট কেশনগুলিতে আবদ্ধ প্রোটিনগুলির সাথে কাজ করার সময়, চেলটিং এজেন্ট ছাড়াই প্রোটেস ইনহিবিটারগুলির মিশ্রণটি স্পেকট্রোস্কোপিক পদ্ধতির (যেমন পারমাণবিক শোষণ স্পেকট্রোফোটোমেট্রি) মাধ্যমে বিশুদ্ধ প্রোটিনের ডিভ্যালেন্ট কেশনগুলির (বা অন্যান্য কোফ্যাক্টর) প্রকৃত উপস্থিতি নিশ্চিত করতে ব্যবহার করতে হবে।

 

5। রিকম্বিন্যান্ট ফেরিডক্সিন (আরএফডি) থার্মোফিলিক সায়ানোব্যাকটিরিয়া ম্যাস্টিগোক্লেডাস ল্যামিনোসাস থেকে একটি একক [2fe ± 2 এস] ক্লাস্টারযুক্ত

ফেরিডক্সিন হ'ল একটি দ্রবণীয় আয়রন-সালফার প্রোটিন যা বৈদ্যুতিন স্থানান্তর প্রতিক্রিয়াতে অংশ নেয়। প্ল্যান্ট-টাইপ ফেরোরেডক্সিন ফটো সিস্টেম I এর একটি ইলেক্ট্রন গ্রহণকারী হিসাবে একটি একক [2fe ± 2s] ক্লাস্টার বহন করে Is এসেরিচিয়া কোলি বিএল 21 (ডিই 3) স্ট্রেন টিবি মিডিয়ামে 10 মিমি এফইসিএল 3 এবং অ্যান্টিবায়োটিকযুক্ত রিকম্বিন্যান্ট আরএফডি প্রোটিন প্রকাশ করেছে। ইমিডাজল এড়াতে এবং [2FE ± 2s] ক্লাস্টার ধ্বংস রোধ করতে 10 মিমি হিস্টিডিনযুক্ত একটি বাফার ব্যবহার করে আইম্যাক ক্যাপচার কলামের এলিউশন সঞ্চালিত হয়েছিল। অ্যানিয়ন এক্সচেঞ্জ এবং আকার বর্জন ক্রোমাটোগ্রাফি ক্রিস্টালাইজেশন স্ক্রিনিংয়ের জন্য আরও বিশুদ্ধকরণ এবং ঘনত্বের জন্য 12mg/এমএল ব্যবহার করা হয়েছিল। ফেরোরেডক্সিনের পুনঃনির্মাণ উত্পাদনের সাথে তুলনা করে, নীল-সবুজ শেত্তলাগুলি থেকে বিশুদ্ধ প্রাকৃতিক ফেরোরেডক্সিনটি স্ফটিককরণের সময় উচ্চতর রেজোলিউশন অর্জন করেছিল।

 

6। অ্যান্টিজেন হিসাবে ব্যবহৃত প্রোটিন

প্রোটিনগুলি প্রায়শই লক্ষ্য-নির্দিষ্ট লিগান্ডগুলি পুনরুদ্ধার করতে অ্যান্টিজেন হিসাবে ব্যবহৃত হয়। প্রথম বিষয়টি বিবেচনা করার বিষয়টি হ'ল প্রচলিত একচেটিয়া বা পলিক্লোনাল আইজিজি পাওয়ার জন্য ভিভো অনাক্রম্যতায় প্রোটিন ব্যবহার করা হয়, বা উট আইজিজি বা ভিট্রো নির্বাচন প্রক্রিয়াগুলিতে জড়িত প্রোগ্রামগুলির জন্য।

 

.1.১ অ্যান্টিজেনগুলি রুটিন অ্যান্টিবডি উত্পাদনের জন্য ব্যবহৃত হয়

যখন অ্যান্টিজেনগুলি একরঙা আইজিজি অ্যান্টিবডিগুলি উত্পাদন করতে ব্যবহৃত হয়, তখন অ্যান্টিজেনের সঠিক ভাঁজ সাধারণত প্রয়োজনীয় হয় না, কারণ বেশিরভাগ একরঙা অ্যান্টিবডিগুলি লিনিয়ার এপিটোপগুলি স্বীকৃতি দেয় যা অ্যান্টিজেনের কাঠামো দ্বারা ব্যাপকভাবে প্রভাবিত হয় না এবং এমনকি ডেনিয়েটেড বডি প্রোটিন হিসাবে) কার্যকর থেকে যায়। যাইহোক, প্রতিরোধের প্রতিক্রিয়াতে হস্তক্ষেপ করা এবং অ-লক্ষ্য অ্যান্টিবডিগুলির আধিপত্য সৃষ্টি করার জন্য শক্তিশালী ইমিউনোজেনিক দূষকগুলি এড়াতে বিশুদ্ধতা অবশ্যই কঠোরভাবে নিয়ন্ত্রণ করতে হবে।

 

6.2 কনজুগেট লাইব্রেরির স্ক্রিনিং

উটের টিকাদান দ্বারা প্রাপ্ত ন্যানোবডি লাইব্রেরির প্রক্রিয়াকরণের সময় অ্যান্টিজেনের প্রাকৃতিক রূপান্তর বজায় রাখার জন্য বিশেষ মনোযোগ দেওয়া উচিত। প্রচলিত অ্যান্টিবডিগুলির বিপরীতে, উট অ্যান্টিবডিগুলি (বিশেষত ন্যানোবডিগুলি) স্ট্রাকচারাল এপিটোপগুলি স্বীকৃতি দেয় যা তাদের অনন্য উত্তল পরিপূরক সাইট কাঠামোর সাথে সম্পর্কিত। একইভাবে, ভিট্রোতে বৃহত সিন্থেটিক বা প্রাকৃতিক অ্যান্টিবডি লাইব্রেরিগুলি স্ক্রিনিং করার সময়, অ্যান্টিজেনকে অবশ্যই একটি কাঠামো বজায় রাখতে হবে যা লক্ষ্য প্রয়োগের সাথে সম্পূর্ণ সামঞ্জস্যপূর্ণ। যেহেতু স্ক্রিনিং প্রক্রিয়াটি নিজেই পক্ষপাতদুষ্ট নয়, যদি অ্যান্টিজেনের ভুল বানান, সংহতকরণ বা কনফরমেশনাল ভিন্ন ভিন্নতা থাকে, তবে অ-প্রাকৃতিক এপিটোপগুলি লক্ষ্য করে বিপুল সংখ্যক কনজুগেটগুলি স্ক্রিন করা যেতে পারে।

 

 

 

7 ... আন্তঃআম্লিকুলার বা ইন্ট্রামোলেকুলার ডিসলফাইড বন্ড বা ফ্রি সিস্টাইনযুক্ত প্রোটিনগুলি

প্রোটিনের প্রাকৃতিক কাঠামোকে স্থিতিশীল করার জন্য ডিসলফাইড বন্ডগুলি গুরুত্বপূর্ণ। পরিশোধন প্রক্রিয়া চলাকালীন, যখন আন্তঃআব্লিকুলার বা ইন্ট্রামোলিকুলার ডিসলফাইড বন্ডযুক্ত প্রোটিনগুলি পরিশোধিত করার সময়, প্রোটিনগুলির কনফরমেশনাল পরিবর্তনগুলি রোধ করতে হ্রাসকারী এজেন্টদের যুক্ত করা এড়াতে হবে, যার ফলে তাদের কার্যকারিতা পরিবর্তন করে। ফ্রি সিস্টাইনযুক্ত প্রোটিনগুলির জন্য, কৃত্রিম ডিসলফাইড বন্ডগুলির গঠন রোধ করার জন্য শুদ্ধকরণ প্রক্রিয়াটির সমস্ত পদক্ষেপে, বিশেষত স্টোরেজ চলাকালীন হ্রাসকারী এজেন্টগুলি অপরিহার্য। সর্বাধিক ব্যবহৃত হ্রাসকারী এজেন্টগুলি হ'ল ডিথিওথ্রিটল (ডিটিটি), -মার্কাপ্টোথেনল (-এমই), এবং ট্রিস (2- কার্বোক্সাইথাইল) ফসফিন হাইড্রোক্লোরাইড (টিসিইপি)। আইএমএসি রেজিনগুলির জন্য যা ডিটিটি বা টিসিইপি -র সাথে বেমানান, এটি -এমই ব্যবহার করতে এবং পরবর্তী পদক্ষেপগুলিতে অন্যান্য হ্রাসকারী এজেন্টগুলির সাথে তাদের প্রতিস্থাপন করার পরামর্শ দেওয়া হয়।

 

8। রিকম্বিন্যান্ট অ্যান্টিবডি খণ্ড

যদিও রিকম্বিন্যান্ট অ্যান্টিবডি খণ্ডগুলির কাঠামো (যেমন ন্যানোবডিগুলি) আইজিজির চেয়ে সহজ, তাদের ফাংশন ডিসলফাইড বন্ডগুলির সঠিক গঠনের উপর নির্ভর করে। ব্যাকটিরিয়া এক্সপ্রেশন সিস্টেমগুলিতে, এমনকি অপ্টিমাইজেশন কৌশলগুলি গ্রহণের পরেও, ভুল বানানো বা আংশিক ভাঁজযুক্ত পণ্যগুলি এখনও ঘটতে পারে, যা দ্রবণীয় অংশ এবং অন্তর্ভুক্তি শরীরে উভয়ই বিদ্যমান। আরও গোপন করা হ'ল এমনকি সঠিকভাবে ভাঁজ করা অ্যান্টিবডি খণ্ডগুলি পৃষ্ঠের হাইড্রোফোবিক ফলকের মাধ্যমে দ্রবণীয় সমষ্টি (কলয়েড সমষ্টি) গঠন করতে পারে। এই জাতীয় সমষ্টিগুলি রুটিন ফাংশনাল টেস্টগুলিতে সনাক্ত করা কঠিন (যেমন এলিএসএ) কারণ মাল্টিভ্যালেন্ট বাইন্ডিং মনোমর সখ্যতা হ্রাসকে মুখোশ দিতে পারে তবে তাদের উপস্থিতি ছোট অণু আকারের উপর নির্ভর করে এমন অ্যাপ্লিকেশনগুলিকে গুরুতরভাবে প্রভাবিত করতে পারে (যেমন সুপার-রেজোলিউশন মাইক্রোস্কোপি)। অতএব, কেবলমাত্র এসডিএস-পৃষ্ঠাগুলির উপর নির্ভর করা নমুনার গুণমানটি মূল্যায়নের জন্য অপর্যাপ্ত। জেল পরিস্রাবণ (চিত্র 3) এর মতো বায়োফিজিকাল পদ্ধতিগুলি অবশ্যই সমষ্টি (বর্জন ভলিউম শিখর) থেকে মনোমর (মূল শিখর) আলাদা করার জন্য গ্রহণ করতে হবে। মূল নিয়ন্ত্রণ পয়েন্টগুলির মধ্যে রয়েছে: ডিসফ্লাইড বন্ড গঠনের প্রচারের জন্য এক্সপ্রেশন চলাকালীন রেডক্স পরিবেশকে অনুকূল করা এবং সমষ্টি রোধে শুদ্ধির পরে স্টোরেজ শর্তগুলি অনুকূল করা। অ্যান্টিবডি খণ্ডগুলির একচেটিয়া এবং কার্যকারিতা নিশ্চিত করার জন্য এই ব্যবস্থাগুলি গুরুত্বপূর্ণ।

চিত্র 3। জেল পরিস্রাবণ ন্যানোবডিগুলির দ্রবণীয় সমষ্টিগুলির পৃথকীকরণ

 

9। লিম্ফোসাইট রিসেপ্টর এলএলটি 1 এর দ্রবণীয় টুকরা

ডিসলফাইড বন্ড-নির্ভর প্রোটিনগুলির পুনঃসংযোগ প্রকাশ (যেমন লিম্ফোসাইট রিসেপ্টর এলএলটি 1) প্রায়শই ভাঁজ অসুবিধার মুখোমুখি হয়। বন্য-প্রকারের এলএলটি 1 এর জেল পরিস্রাবণটি একত্রিতকরণ শৃঙ্গ এবং ডাইমার শৃঙ্গগুলি (চিত্র 4 এ) দেখিয়েছিল, তবে ভর স্পেকট্রোম্যাট্রি ডাইমারে (চিত্র 4 বি) অবিচ্ছিন্ন সিস্টাইন দ্বারা সৃষ্ট ভুল বানান প্রকাশ করেছে। এই উদ্দেশ্যে, দুটি মিউট্যান্ট ডিজাইন করা হয়েছিল: একটি সমস্যা সিস্টেস্টিন অপসারণ করেছে, ফলস্বরূপ ফলন হঠাৎ হ্রাস পায় (চিত্র 4 এ); কনফর্মড ডিসলফাইড বন্ডটি পুনর্গঠনের জন্য নিওসিস্টাইন প্রবর্তনের পরে, মিউট্যান্টের কেবল উচ্চ ফলন এবং ভাল স্থিতিশীলতা ছিল না, তবে ক্রিস্টালাইজ করতে পারে (চিত্র 4 সি), এবং 3 ডি কাঠামো নিশ্চিত করেছে যে মিউট্যান্ট সঠিক ডিসলফাইড বন্ড গঠন করেছে এবং প্রাকৃতিক ভাঁজ বজায় রেখেছিল। এই কেসটি প্রমাণ করে যে জেল পরিস্রাবণ এবং ভর স্পেকট্রোম্যাট্রি বিশ্লেষণের সাথে মিলিতভাবে কনফর্মাল ডিসফ্লিফাইড বন্ডগুলি যুক্ত করে ডিজাইনের মাধ্যমে, রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিনগুলির ভাঁজ সমস্যাটি কার্যকরভাবে সমাধান করা যেতে পারে এবং স্থিতিশীল কাঠামো এবং উচ্চ ফলন সহ কার্যকরী প্রোটিন পাওয়া যায়।

চিত্র 4। ডিসলফাইড বন্ড পুনর্গঠন দ্রবণীয় এলএলটি 1 এর ভাঁজ এবং ফলন উন্নত করে

 

 

 

10। সহজেই সমষ্টিযোগ্য প্রোটিন

রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিনগুলির পরিশোধন প্রায়শই সংহতকরণের সমস্যার মুখোমুখি হয় এবং এর গঠন "নিউক্লিয়েশন-বৃদ্ধি" প্রক্রিয়া অনুসরণ করে-প্রথমে অল্প পরিমাণে দ্রবণীয় সমষ্টি গঠন করে এবং তারপরে বড় আকারের দ্রবণীয় সমষ্টিকে ট্রিগার করে। এই চ্যালেঞ্জটি মোকাবেলার জন্য, বহু-স্তরের কৌশলগুলি গ্রহণ করা দরকার: অভিব্যক্তি পর্যায়ে, স্ট্রেনকে অনুকূলিতকরণ, সংস্কৃতি তাপমাত্রা হ্রাস করে, পরিবর্তিত সংস্কৃতি মিডিয়া বা বিভিন্ন দ্রবণীয় ফিউশন প্রোটিন ব্যবহার করে এবং এক্সপ্রেশন সিস্টেমগুলি (পোকামাকড়/স্তন্যপায়ী কোষগুলি প্রতিস্থাপন করা), প্রোটিনকে (একটি 4 ডিগ্রি সি পরিবেশের মধ্যে) (দ্রুত অপারেশন হিসাবে) (দ্রুত অপারেশন এ এড়াতে হয় (এটি একটি 4 ডিগ্রি সি। আইম্যাক টু সেকেন্ড) তাত্ক্ষণিকভাবে সামগ্রিক নিউক্লিয়াস অপসারণের জন্য গ্রহণ করা উচিত। সাধারণভাবে বলতে গেলে, বাফার সমাধানগুলি স্ক্রিনিং করার সময়, উপাদান যেমন উপাদান রচনা, পিএইচ মান, বিযুক্তকারী এজেন্ট বা সলিউবিলাইজারের মতো উপাদানগুলি বিবেচনায় নেওয়া উচিত (চিত্র 5)। অরথোগোনাল সনাক্তকরণের সূক্ষ্ম অপ্টিমাইজেশনের মাধ্যমে (যেমন এসইসি, সিডি, এলএস, ডিএসএফ এবং ফ্লুরোসেন্স তাপের উপর ভিত্তি করে তাপমাত্রা শিফট ইত্যাদি) প্রোটিনের গুণমান এবং সর্বাধিক উপযুক্ত বাফার সমাধান নির্ধারণ করা হয়েছিল।

চিত্র 5। প্রোটিন একীকরণ হ্রাস করার কৌশল

 

১১। হিউম্যান সিএলকে 1 কিনেসের স্ফটিককরণ (কীভাবে পুনরুত্পাদনযোগ্য ব্যাচগুলি পাবেন)

ক্রিস্টালাইজেশন স্টাডিজের জন্য একজাতীয় অ-ফসফোরিলেটেড সিএলকে 1 কিনেস পেতে, একটি বহু-কৌশল সহযোগী স্কিম গৃহীত হয়েছিল। প্রথমত, এটি অটোফসফোরিলেশনের বৈচিত্র্য দূর করার জন্য Esc যদিও ফলন হ্রাস পেয়েছিল, সম্পূর্ণ ডিফোসফোরিলেশন নিশ্চিত করা হয়েছিল। আইএমএসি দ্বারা ক্যাপচারের পরে, একত্রিতকরণ, ঘনীভূত রোধ করতে স্ট্যাবিলাইজারগুলি (50 মিমি আর্গিনাইন, 50 মিমি গ্লুটামিক অ্যাসিড এবং 10 মিমি ডিটিটি) দিয়ে পরিপূরক করা হয়েছিল এবং তার ট্যাগটি টিইভি হজম দ্বারা সরানো হয়েছিল। তারপরে, সঠিক অলিগোমার এসইসি দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল (5% গ্লিসারল এবং -me সমন্বিত)। চূড়ান্ত গুরুত্বপূর্ণ অ্যানিয়ন এক্সচেঞ্জ পদক্ষেপটি স্ফটিক (নন-ফসফোরিলেটেড) এবং নন-স্ফটিক (আংশিকভাবে ফসফোরিলেটেড) সিএলকে 1 গ্রুপগুলির মধ্যে পার্থক্য করে। এটি বিশেষভাবে লক্ষণীয় যে সেল লিসিসের মোডটি প্রোটিনের স্থিতিশীলতাটিকে উল্লেখযোগ্যভাবে প্রভাবিত করে-উচ্চ-চাপ এবং উচ্চ-তাপমাত্রা পদ্ধতি সিএলকে 1 এর অপরিবর্তনীয় সমষ্টিকে নিয়ে যায়, কিনেস প্রস্তুতির জন্য হালকা চিকিত্সার গুরুত্বকে তুলে ধরে।

 

 

 

12। স্থিতিশীল লিগ্যান্ড-বাইন্ডিং ক্ষমতা সহ গ্যালেক্টিন -1 উত্পাদন করুন

লিগান্ড বাইন্ডিং স্টাডিজের জন্য কার্যকরী গ্যালেক্টিন -1 প্রস্তুত করার জন্য, চারটি নির্মাণের অভিব্যক্তি এবং পরিশোধন কৌশলগুলি (লেবেলযুক্ত এবং তাঁর লেবেলযুক্ত বন্য-প্রকারের গ্যালেক্টিন -1, লেবেলযুক্ত এবং তাঁর লেবেলযুক্ত সিস্টাইন-মুক্ত মিউট্যান্ট গ্যালেক্টিন {6}})})})} মূল অনুসন্ধানগুলি ইঙ্গিত দেয় যে ল্যাকটোজ অ্যাফিনিটি ক্রোমাটোগ্রাফি পরিশোধন সঠিকভাবে ভাঁজ করা প্রোটিনগুলির জন্য কার্যকরভাবে স্ক্রিন করতে পারে তবে এটি বাইন্ডিং সাইট থেকে ল্যাকটোজ সম্পূর্ণরূপে অপসারণ করতে এবং সিআরডি ক্রিয়াকলাপ পুনরুদ্ধার করতে পুঙ্খানুপুঙ্খ ডায়ালাইসিস (এইচপিইএস বাফার) এর সাথে একত্রিত করা দরকার। বন্য-প্রকারের গ্যালেক্টিন -1 জারণ এবং নিষ্ক্রিয়করণের ঝুঁকিতে রয়েছে এবং এর স্থায়িত্বও হ্রাসকারী এজেন্টগুলির উপস্থিতিতে সীমাবদ্ধ থেকে যায় (চিত্র 6)। যাইহোক, সিস্টাইন-মুক্ত মিউট্যান্ট তুলনামূলক অ্যাগেলিউটেশন ক্রিয়াকলাপ এবং তাপীয় স্থায়িত্ব (ন্যানোডএসএফ, আইটিসি, ইত্যাদি দ্বারা যাচাই করা) ডিসলফাইড বন্ড নির্ভরতা দূর করে বজায় রেখে দীর্ঘমেয়াদী স্থিতিশীলতা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করে।

চিত্র 6। রিকম্বিন্যান্ট গ্যালেক্টিনের হাইড্রোডাইনামিক বৈশিষ্ট্য -1 এর অস্থিরতা প্রকাশ করে

 

13। এন্ডোটক্সিন অপসারণ

এন্ডোটক্সিন অপসারণ পদ্ধতিটি ইতিবাচক চার্জযুক্ত ক্রোমাটোগ্রাফি (অ্যানিয়ন এক্সচেঞ্জ), পলিয়েশনিক লিগান্ডগুলির (যেমন পলি-এল-লাইসাইন (পিএলএল), স্থাবর পলিমাইন (পলিমিক্সিন বি)) এবং সার্ফ্যাক্ট্যান্ট ট্রিটন এক্স {{{{{} {{}}}}}} on সহ অ্যাফিনিটি ক্রোমাটোগ্রাফির উপর ভিত্তি করে। পরিশোধন প্রক্রিয়া চলাকালীন, এলপিএস-মুক্ত জল দিয়ে বাফার সমাধান প্রস্তুত করার দিকে মনোযোগ দিন এবং নতুন কলাম বা কলামগুলি ব্যবহার করুন যা কেবলমাত্র অন্যান্য এলপিএস-মুক্ত শুদ্ধিতে ব্যবহৃত হয়েছে। এন্ডোটক্সিন দূষণের জন্য, ক্রোমাটোগ্রাফিক পাম্প/ফ্লুইড সিস্টেমটি 0। নমুনায় এলপিএসের চূড়ান্ত পরিমাণটি লিমুলাস অ্যামিবোসাইট লাইসেট রিএজেন্ট (এলএল) ব্যবহার করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল এবং এটি নির্দিষ্ট অ্যাপ্লিকেশনটির জন্য প্রয়োজনীয় সীমাটির নীচে ছিল কিনা তা যাচাই করা হয়েছিল।

 

14। প্রোটিন কমপ্লেক্স

প্রোটিন কমপ্লেক্সগুলির অভিব্যক্তি এবং পরিশোধন নির্দিষ্ট শর্ত অনুযায়ী অনুকূলিত করা প্রয়োজন। চ্যালেঞ্জগুলির মধ্যে সাবুনিটগুলির অস্থিরতা বা ভুল বানান অন্তর্ভুক্ত। প্রতিটি সাবুনিট স্বাধীনভাবে প্রকাশ করা যেতে পারে এবং ভিট্রোতে একত্রিত হতে পারে, বা কার্যকরী প্রোটিন কমপ্লেক্স গঠনের জন্য সহ-প্রকাশ করা যায়। সমাবেশে হস্তক্ষেপ এড়াতে শুদ্ধকরণ বা সনাক্তকরণ লেবেলগুলির সাথে সাবধানতার সাথে চালু করা উচিত, বিশেষত যখন জটিল তথ্য সীমিত থাকে এবং একাধিক অপ্টিমাইজেশন প্রয়োজন হয়। পরিশোধন প্রক্রিয়া চলাকালীন, জটিলটির অখণ্ডতা এবং স্থিতিশীলতা মূল্যায়ন করা প্রয়োজন। পদ্ধতিগুলির মধ্যে রয়েছে এসডিএস-পৃষ্ঠা (সাবুনিট সনাক্তকরণ), এসইসি (সমজাতীয়তা), সেক-ম্যালস (মোলার ভর বিশ্লেষণ), ভর ফটোমেট্রি বা প্রাকৃতিক ভর স্পেকট্রোম্যাট্রি (ভর যাচাইকরণ)। এটি লক্ষ করা উচিত যে কমপ্লেক্সটি কম ঘনত্বের মধ্যে বিচ্ছিন্ন হতে পারে। এই মুহুর্তে, ক্রোমাটোগ্রাফিক পদ্ধতি বা বাফার (যেমন তাপীয় ড্রিফ্ট বা ডিএসএফ স্ক্রিনিং শর্তের মাধ্যমে) অনুকূলিত করা দরকার। তদ্ব্যতীত, পরিশোধন পদক্ষেপগুলি হ্রাস করা দুর্বল ইন্টারঅ্যাকশন সাবুনিটগুলির ক্ষতি রোধ করতে পারে এবং শুদ্ধকরণ দক্ষতা এবং কমপ্লেক্সের অখণ্ডতা ভারসাম্য বজায় রাখতে পারে।

 

 

 

15। অ্যান্টিজেন-অ্যান্টিবডি কমপ্লেক্সের পরিশোধন

অ্যান্টিবডি-অ্যান্টিজেন কমপ্লেক্সগুলি প্রোটিন কমপ্লেক্সগুলির সাধারণ উদাহরণ। তাদের সহ-স্ফটিককরণ বাইন্ডিং নিদর্শনগুলি প্রকাশ করতে পারে এবং অ্যান্টিবডি ইঞ্জিনিয়ারিংয়ের অপ্টিমাইজেশনকে গাইড করতে পারে। Dition তিহ্যবাহী পদ্ধতিতে অ্যান্টিজেন এবং অ্যান্টিবডিগুলির পৃথক পরিশোধন প্রয়োজন এবং তারপরে সেগুলি মিশ্রিত করা হয়। যাইহোক, সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে সহ-প্রকাশ এবং সহ-পরিশোধন কৌশলগুলি আরও দক্ষ। কমপ্লেক্সটি অর্জনের জন্য কেবল একটি একক পরিশোধন প্রয়োজন এবং একই সময়ে, অ্যান্টিবডিগুলির মাধ্যমে অস্থির অ্যান্টিজেনগুলি স্থিতিশীল করা যায় এবং এমনকি লেবেল-মুক্ত এক্সপ্রেশনও অর্জন করা যায়। এই নির্দিষ্ট পরিস্থিতিতে, এসডিএস-পৃষ্ঠা এবং জেল পরিস্রাবণ (এসইসি) সাধারণত কমপ্লেক্সের বিশুদ্ধতা এবং গুণমান মূল্যায়নের জন্য যথেষ্ট।

 

সংক্ষিপ্তসার

প্রোটিন পরিশোধন বৈজ্ঞানিক গবেষণায় একটি মৌলিক প্রযুক্তি। একাডেমিক-স্কেল প্রোটিন উত্পাদন সাধারণত স্ট্যান্ডার্ড কৌশলগুলি অনুসরণ করে এবং মিলিগ্রাম-স্তরের উচ্চ-বিশুদ্ধতা, দ্রবণীয় প্রোটিন তৈরি করতে পারে, যা কাঠামোগত জীববিজ্ঞান, জৈব রসায়ন এবং কার্যকরী গবেষণায় ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়। যাইহোক, ডাউন স্ট্রিম অ্যাপ্লিকেশনগুলির বিশেষ প্রয়োজনীয়তা (যেমন প্রাণী পরীক্ষায় এন্ডোটক্সিনের প্রয়োজন এবং নিউক্লিক অ্যাসিড গবেষণায় নিউক্লিজ দূষণ নয়) বা প্রোটিনের অন্তর্নিহিত বৈশিষ্ট্যগুলি (যেমন সহজ সংহতকরণ, ডিসলফাইড বন্ড বা উচ্চ নিউক্লিক অ্যাসিডের সখ্যতাযুক্ত) প্রায়শই কাস্টমাইজড সমাধানের প্রয়োজন হয়। এই পর্যালোচনা, এই বিশেষ পরিস্থিতির প্রতিক্রিয়া হিসাবে, এক্সপ্রেশন সিস্টেম নির্বাচন, নির্মাণের নকশা (লেবেল এবং ডোমেন সীমানা অনুকূলকরণ) থেকে পরিশোধিত প্রক্রিয়া থেকে শুরু করে পরিশোধিত কৌশলগুলির প্রস্তাব দেয় এবং মূল পদক্ষেপে গুণমান নিয়ন্ত্রণ (যেমন এসইসি, এসডিএস-পৃষ্ঠা, ক্রিয়াকলাপ সনাক্তকরণ ইত্যাদি) প্রবর্তন করে। কিছু অ্যাপ্লিকেশনগুলির জন্য সিস্টেমেটিক প্রক্রিয়াগুলির মাধ্যমে ত্রুটিগুলি রোধ করার জন্য বায়োফর্মাসিউটিক্যাল শিল্পে "গুণমানের আশ্বাস" (কিউএ) ধারণার অনুরূপ অতিরিক্ত বিশ্লেষণ (যেমন এন্ডোটক্সিন সনাক্তকরণ এবং নিউক্লিক অ্যাসিডের অবশিষ্টাংশ নির্ধারণ) প্রয়োজন। মানসম্পন্ন নিয়ন্ত্রণ নির্দেশিকা তৈরি করে এবং বৈজ্ঞানিক গবেষণায় ব্যবহৃত প্রোটিন রিএজেন্টগুলির জন্য নির্দিষ্ট মানগুলি স্পষ্ট করে, লক্ষ্যটি হ'ল একাডেমিক পরীক্ষাগারগুলির জন্য আরও কঠোর প্রোটিন পরিশোধন নিয়ম প্রতিষ্ঠা করা, পরীক্ষামূলক তথ্যের নির্ভরযোগ্যতা এবং পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা বাড়ানো এবং মৌলিক গবেষণা এবং শিল্প মানের মধ্যে ব্যবধানটি পূরণ করা।

 

Doi: 10.1186/s 12934-022-01778-5