আবেদনUমধ্যে ltrafiltrationEএর xtractionNaturalCওলাজেন

 

Ⅰ.কোলাজেন কি?

কোলাজেন হল একটি বায়োপলিমার, যা প্রাণীদের সংযোজক টিস্যুর প্রধান উপাদান, এবং এছাড়াও স্তন্যপায়ী প্রাণীদের মধ্যে সর্বাধিক প্রচুর এবং ব্যাপকভাবে বিতরণ করা কার্যকরী প্রোটিন, যা মোট প্রোটিনের 25%–30% এবং এমনকি কিছু কিছুতে 80% এরও বেশি। জীব এটি প্রাণী কোষে বাঁধাইকারী টিস্যুর ভূমিকা পালন করে।

পরিমাপ অনুসারে, একজন প্রাপ্তবয়স্ক ব্যক্তির শরীরে প্রায় 3 কেজি কোলাজেন থাকে, যা প্রধানত ত্বক, হাড়, চোখ, দাঁত, টেন্ডন, অভ্যন্তরীণ অঙ্গ (হার্ট, পেট, অন্ত্র এবং রক্তনালী সহ) এবং অন্যান্য অংশে থাকে। মানুষের শরীরের। এর কাজ হল ত্বক এবং অঙ্গগুলির অঙ্গসংস্থান এবং গঠন বজায় রাখা এবং এটি ক্ষতিগ্রস্ত টিস্যুগুলির মেরামতের জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ কাঁচামাল।

২. আল্ট্রাফিল্ট্রেশন দ্বারা গ্রাস কার্প স্কেল থেকে কোলাজেন নিষ্কাশন

1. উপকরণ এবং পদ্ধতি

1.1 টেস্ট নমুনা

অশোধিত কোলাজেনের জলীয় নির্যাস।

1.2 পরীক্ষা পদ্ধতি

1.2.1 আল্ট্রাফিল্ট্রেশন প্রক্রিয়া

1.2.2 প্রাক-পরিস্রাবণ প্রক্রিয়া নির্ধারণ

এই পরীক্ষায়, ভ্যাকুয়াম পরিস্রাবণ পদ্ধতি এবং মাইক্রোফিল্ট্রেশন পদ্ধতির তুলনামূলক বিশ্লেষণের মাধ্যমে সর্বোত্তম প্রাক-পরিস্রাবণ প্রক্রিয়া নির্ধারণ করা হয়। নির্দিষ্ট পরীক্ষার পদ্ধতি নিম্নরূপ:

① অশোধিত কোলাজেন জলীয় নির্যাস একটি ফিল্টার পেপার ভ্যাকুয়াম পরিস্রাবণ পদ্ধতি দ্বারা ফিল্টার করা হয় যাতে জলীয় নির্যাসের মধ্যে স্থগিত কণা এবং অমেধ্য অপসারণ করা হয়।

② অপরিশোধিত কোলাজেন জলীয় নির্যাস একটি 0.2 μm মাইক্রোফিল্ট্রেশন ঝিল্লি দিয়ে ফিল্টার করা হয় যাতে জলীয় নির্যাসের অদ্রবণীয় পদার্থ, অমেধ্য ইত্যাদি অপসারণ করা হয়।

1.2.3 আল্ট্রাফিল্ট্রেশন মেমব্রেনের ছিদ্র আকারের পছন্দ

পরিশোধনের সময়, আল্ট্রাফিল্ট্রেশন মেমব্রেনের ছিদ্রের আকার 100 kDa হয়।

1.2.4 আল্ট্রাফিল্ট্রেশন পরিশোধন প্রক্রিয়ার একক ফ্যাক্টর পরীক্ষা

অপরিশোধিত কোলাজেনের জলীয় নির্যাস আল্ট্রাফিল্ট্রেশন প্রযুক্তি দ্বারা বিশুদ্ধ হয়। কোলাজেন ধরে রাখার উপর অপারেটিং চাপ, অপারেটিং তাপমাত্রা এবং pH এর প্রভাবের একক ফ্যাক্টর পরীক্ষা অধ্যয়ন করুন। কিছু সময়ের জন্য আল্ট্রাফিল্ট্রেশন সরঞ্জাম শুরু করার পরে, কোলাজেন ধরে রাখার হারের উপর বিভিন্ন কারণের প্রভাব অধ্যয়ন করুন।

1.2.5 গণনার সূত্র

2. ফলাফল এবং বিশ্লেষণ

2.1 প্রাক-পরিস্রাবণ প্রক্রিয়া বিশ্লেষণ

ভ্যাকুয়াম পরিস্রাবণ পদ্ধতি এবং মাইক্রোফিল্ট্রেশন পদ্ধতির তুলনা ফলাফলের জন্য নীচের টেবিলটি দেখুন।

পরিস্রাবণ পদ্ধতি	পরিস্রাবণের আগে সমাধান ঘনত্ব/(g/L)	পরিস্রাবণের পরে সমাধান ঘনত্ব/(g/L)	সংবেদনশীল ঘটনা
ভ্যাকুয়াম পরিস্রাবণ পদ্ধতি	0.45	0.35	পরিস্রাবণের শেষে দ্রবণটি পরিষ্কার হয়, তবে কিছু সময়ের জন্য রেখে দেওয়ার পরে এটি ঘোলা হয়ে যায়।
মাইক্রোফিল্ট্রেশন পদ্ধতি	0.45	0.42	দ্রবণটি পরিস্রাবণের শেষে পরিষ্কার হয় এবং নির্দিষ্ট সময়ের জন্য রেখে দেওয়ার পরেও পরিষ্কার থাকে

 

এটি টেবিল থেকে দেখা যায় যে ভ্যাকুয়াম পরিস্রাবণ পদ্ধতি এবং মাইক্রোফিল্ট্রেশন পদ্ধতি উভয়ই দ্রবণের অমেধ্য এবং অদ্রবণীয় কঠিন পদার্থগুলিকে অপসারণ করতে পারে, তবে মাইক্রোফিল্ট্রেশন পদ্ধতি প্রোটিনের উপর একটি ভাল সুরক্ষা প্রভাব ফেলে, অর্থাৎ ক্ষতি উল্লেখযোগ্য নয়, এবং ভ্যাকুয়াম পরিস্রাবণ পদ্ধতি প্রোটিনের ক্ষতির জন্য দায়ী। উপরন্তু, ভ্যাকুয়াম পরিস্রাবণ দ্বারা একটি নির্দিষ্ট সময়ের জন্য স্থাপন করার পরে পরিস্রাবণ মেঘলা থাকে, যখন মাইক্রোফিল্ট্রেশন এখনও পরিষ্কার এবং স্বচ্ছ থাকে, তাই মাইক্রোফিল্ট্রেশনকে আল্ট্রাফিল্ট্রেশনের প্রিট্রিটমেন্ট প্রক্রিয়া হিসাবে নির্বাচিত করা হয়।

2.2 আল্ট্রাফিল্ট্রেশন প্রক্রিয়ার একক ফ্যাক্টর পরীক্ষা

2.2.1 ধরে রাখার হারের উপর আল্ট্রাফিল্ট্রেশন চাপের প্রভাব

তাপমাত্রা 40 ডিগ্রী এবং pH 9৷{3}}, বিভিন্ন আল্ট্রাফিল্ট্রেশন চাপের প্রভাবগুলি অধ্যয়ন করুন (0৷{7}}7MPa, 0৷ {11}}9MPa, 0.11MPa, 0.13MPa এবং 0.15MPa) প্রোটিন ধরে রাখার হারে। ফলাফল নীচের চিত্রে দেখানো হয়েছে.

 

উপরের চিত্র থেকে দেখা যায়, অপারেটিং চাপ বৃদ্ধির সাথে সাথে প্রোটিনের বাধার হার ধীরে ধীরে হ্রাস পায়। {{0}}৷{8}}7MPa, প্রোটিন ধরে রাখার হার হল 96.53%, যখন অপারেটিং চাপ 0.15MPa হয়, তখন প্রোটিন ধরে রাখার হার 84.38%৷ কারণ আল্ট্রাফিল্ট্রেশন দ্বারা পদার্থের পৃথকীকরণ চাপের পার্থক্য দ্বারা চালিত হয়। কম অপারেটিং চাপের সেই পরিসরে, ছোট আণবিক পদার্থ দ্রুত ঝিল্লির মধ্য দিয়ে যেতে পারে, তবে ম্যাক্রোমলিকুলার পদার্থগুলি অতিপরিস্রাবণ ঝিল্লি দ্বারা আটকে যেতে পারে এবং ঝিল্লির পৃষ্ঠে জমা হতে পারে এবং এই মুহূর্তে ঝিল্লির উপরিভাগ এবং জলীয় পদার্থ। নির্যাস ফর্ম ঘনত্ব পার্থক্য ঘনত্ব পার্থক্য মেরুকরণ প্রতিরোধের কারণ; যাইহোক, চাপ বৃদ্ধির সাথে সাথে, ঘনত্বের মেরুকরণ প্রতিরোধ ক্ষমতা ধীরে ধীরে বৃদ্ধি পায়, এবং ঝিল্লি পৃষ্ঠ এবং জলীয় নির্যাসের মধ্যে ঘনত্বের পার্থক্য ভারসাম্যে পৌঁছায়। যখন চাপ এই ভারসাম্যকে অতিক্রম করে, তখন ঝিল্লির পৃষ্ঠে একটি জেল স্তর লেখা যেতে পারে (যা ঘনত্বের মেরুকরণের তত্ত্বের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ ছিল এবং আল্ট্রাফিল্ট্রেশনের সময় গঠিত জেল স্তর)। চাপ ক্রমাগত বাড়তে থাকে, এবং জেল স্তরের পুরুত্ব বৃদ্ধি পায়, এবং ঝিল্লির পৃষ্ঠে অবশিষ্ট প্রোটিন বৃদ্ধি পায়, যার ফলে ধরে রাখার হার কম হয়। ঝিল্লির বিচ্ছেদ প্রভাব নিশ্চিত করার জন্য, সর্বোত্তম অপারেটিং চাপ পরামিতি হল 0.07MPa।

2.2.2 প্রোটিন ধরে রাখার হারের উপর তাপমাত্রার প্রভাব

চাপের অবস্থার অধীনে {{0}}.11MPa, pH 9.0, প্রোটিন ধরে রাখার উপর বিভিন্ন তাপমাত্রার (25 ডিগ্রি, 30 ডিগ্রি, 35 ডিগ্রি, 40 ডিগ্রি এবং 45 ডিগ্রি) প্রভাব অধ্যয়ন করুন। ফলাফল নীচের চিত্রে দেখানো হয়েছে.

 

উপরের চিত্রে দেখানো হয়েছে, তাপমাত্রা বৃদ্ধির সাথে সাথে, আল্ট্রাফিল্ট্রেশন মেমব্রেনের ধরে রাখার হার ধীরে ধীরে বৃদ্ধি পায় এবং এটি 45 ডিগ্রীতে সর্বোচ্চে পৌঁছায়, ধরে রাখার হার হল 97.01%। কারণ কোলাজেনের সান্দ্রতা তাপমাত্রার সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত: যখন তাপমাত্রা কম থাকে, তখন কোলাজেনের সান্দ্রতা বড় হয় এবং এইভাবে কোলাজেন ঝিল্লির পৃষ্ঠে প্রতিরোধ গড়ে তুলতে সহজ হয়, যার ফলে ধারণ হার কম হয়। যখন তাপমাত্রা বৃদ্ধি পায়, কোলাজেনের সান্দ্রতা হ্রাস পায় এবং কোলাজেন অণুর মধ্যে মিথস্ক্রিয়া দুর্বল হয়, যার ফলে ভর স্থানান্তর হার বৃদ্ধি পায়, এবং ঘনত্ব মেরুকরণ দুর্বল হয়, যার ফলে ধরে রাখার হার বৃদ্ধি পায়। ধারণ হার বৃদ্ধির আরেকটি কারণ হল তাপমাত্রা বৃদ্ধি পায় এবং সেই অনুযায়ী কোলাজেনের দ্রবণীয়তা বৃদ্ধি পায় এবং কোলাজেন মেমব্রেনকে অবরুদ্ধ করার ঘটনা হ্রাস পায়। অতএব, আল্ট্রাফিল্ট্রেশনের জন্য সর্বোত্তম তাপমাত্রা হল 45 ডিগ্রি।

2.2.3 প্রোটিন ধরে রাখার উপর pH এর প্রভাব

চাপের অবস্থার অধীনে {{0}}.11MPa এবং তাপমাত্রা 40 ডিগ্রি, বিভিন্ন pH অবস্থার প্রভাব অধ্যয়ন করুন, যথা pH=6৷{8}}, pH{ {5}}৷{10}}, pH=8.0, pH=9.0 এবং pH=10.0, ধরে রাখার হারে৷ ফলাফল নীচের চিত্রে দেখানো হয়েছে.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7, পিএইচ বৃদ্ধির সাথে ধরে রাখার হার ধীরে ধীরে বৃদ্ধি পায়। এর কারণ হল আল্ট্রাফিল্ট্রেশন মেমব্রেন হল ঋণাত্মক চার্জ সহ পলিথার ম্যাপেল মেমব্রেন, ক্ষারীয় অবস্থায় নেতিবাচক চার্জ সহ কোলাজেন, নেতিবাচক চার্জযুক্ত কোলাজেন অণু এবং একই চার্জ সহ আল্ট্রাফিল্ট্রেশন মেমব্রেন একটি পারস্পরিক একচেটিয়া অবস্থা তৈরি করে, যাতে কোলাজেন অণুগুলি পৃষ্ঠে থাকা সহজ নয়। ঝিল্লির, ঝিল্লি ব্লক করা সহজ নয়, তাই আল্ট্রাফিল্ট্রেশনের সর্বোত্তম pH হল 8-10।

2.3 আল্ট্রাফিল্ট্রেশন প্রক্রিয়া অপ্টিমাইজেশান এবং ফলাফলের বৈধতা

ডিজাইন-এক্সপার্ট8 দ্বারা বিশ্লেষণ৷{3}}5 সফ্টওয়্যার দেখায় যে সর্বোত্তম প্রক্রিয়া পরামিতিগুলি নিম্নরূপ: অপারেটিং চাপ 0.14MPa, অপারেটিং তাপমাত্রা 40.98 ডিগ্রি , এবং সমাধান pH=9.43৷ এই অবস্থার অধীনে, ধরে রাখার হার ছিল 92.551%। প্রকৃত পরামিতিগুলির অপারেবিলিটি বিবেচনা করে, অপারেটিং চাপ হল 0.14MPa, অপারেটিং তাপমাত্রা হল 40 ডিগ্রী এবং ফিড তরলের pH মান হল আল্ট্রাফিল্ট্রেশন অবস্থার অধীনে 9.50। আল্ট্রাফিল্ট্রেশন ডিভাইসের সিস্টেম স্থিতিশীল হতে শুরু করার পরে পরীক্ষামূলক যাচাইকরণ শুরু হয়। প্রাপ্ত ধারণ হারের ফলাফল হল (92।{17}}.1)% (n=3)। সমীকরণের পূর্বাভাসিত মান মূলত পরিমাপ করা মানের অনুরূপ, যা নির্দেশ করে যে পূর্বাভাসিত শর্তসাপেক্ষ প্যারামিটার ফলাফল প্রকৃত শর্তসাপেক্ষ ফলাফলের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ।

2.4 ইলেক্ট্রোফোরেসিস বিশ্লেষণের ফলাফল

বিশুদ্ধ কোলাজেন SDS-PAGE ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়, এবং ফলাফলগুলি নীচের চিত্রে দেখানো হয়েছে।

উপরের চিত্রে দেখানো হয়েছে, লেন 1 হল এই পরীক্ষায় বিশুদ্ধ কোলাজেন এবং লেন 2 হল বাছুরের টেন্ডনের আদর্শ কোলাজেন নমুনা। এটি এসডিএস-পেজ ইলেক্ট্রোফোরেসিস থেকে দেখা যেতে পারে যে এই পরীক্ষায় প্রস্তাবিত কোলাজেন প্রোটিন কোলাজেন হিসাবে চিহ্নিত করা যেতে পারে, তবে A1 পেপটাইড চেইন এবং a2 পেপটাইড চেইনের আপাতদৃষ্টিতে অস্পষ্ট সীমানা স্পষ্ট নয়। ইলেক্ট্রোফোরেসিস থেকে এটা স্পষ্ট যে অন্য কোন প্রোটিন ব্যান্ড নেই এবং এটা উপসংহারে আসা যেতে পারে যে বিশুদ্ধ কোলাজেনের বিশুদ্ধতা বেশি।